实验步骤:

1、插入拨片架上放入60-65℃C的烤箱中，烤片1-1.5小时。

2、脱蜡水化:二甲苯1，10min→二甲苯2,10min→二甲苯35min→无水乙醇1，5min一无水乙醇2，5min→95%乙醇5min→85%乙醇，5min→蒸馏水清洗。

3、抗原修复:组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(PH9.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。中火至沸后断电，间隔 10min中低火至沸，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片，(自然冷却后将玻片置于PBS(PH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定)

4、阻断内源性过氧化物酶:切片放入3%H202溶液中,室温避4、光孵育15min→切片在PBS(PH7.4)中脱色,床上晃动洗涤5min*3.

5、破细胞膜(仅核蛋白和部分胞浆蛋白):将Tritonx-100用PBS 稀释至 0.5%后，适量滴加覆盖组织，室温孵育15分钟后，切片用PBS溶液冲洗3次，每次5分钟。

6、BSA 封闭:切片稍用干后用组化笔在组织周围画圈(防止抗体流走)，在圈内滴加用3%BSA或者山羊血清均匀覆盖组织，室温封闭30min。

7、孵一抗:轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS/抗体稀释液按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4C孵育过夜(泪盒内加少量水防止抗体蒸发)

8、孵 hrp 二抗:玻片置于 PBS(PH7.4)中洗3次，每次5min切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织,避光室温孵育 50min,PBs洗三次。

9、TSA荧光染料反应液反应:浓缩型荧光染料与TSA buffer按照1:50-1:200的比例混合均匀，切片滴加配好的TSA英光染料反应液均匀覆盖组织室温反应1-15min(最佳时间5min-10min),PBS洗三次(预实验可先染 1min洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一步)。

10、抗体洗脱:石蜡切片置于抗原修复液中95度水浴25-40min(根据不同抗体亲和力，灵活调整时间)或者滴加适量37度预热至完全溶解的mIHC专用抗体洗脱液(冰冻切片、爬片、骨组织建议用)覆盖样本，37度放置5-20分钟，弃去洗脱液再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本 37 度放置5-20分钟弃洗脱液，PBS洗三次，每次5分钟。

11、重复4-8步骤(换另一种荧光染料第二轮标记)

12、DAPI复染细胞核:玻片置于PBS(PH7.4)中洗3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育3/10min。

13、封片:玻片置于 PBS(PH7.4)中洗3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片(不含 DAPD)。

14、拍照:切片于倒置荧光显微镜下观察并采集图像。(紫外激发波长330-380nm，发射波长 420nm;FITC绿光激发波长465-495nm，发射波长515-555nm;CY3红光激发波长510-560发射波长590nm)

注意事项：

样品：

尽量选用新鲜制备的样本；

确定样品中抗原分子的表达丰度；

细胞/冰冻切片检测胞内蛋白或抗原表位在胞内的膜蛋白需要进行通透处理；

如果检测抗原表位位于胞外段的是跨膜蛋白，则不需要进行通透处理；

采用丙酮固定组织的切片，因丙酮本身具有通透作用，不需要额外的通透操作；

抗体：

选择适用于免疫荧光的抗体；

通过实验确定最佳稀释比例；

选用二抗应匹配一抗来源物种；

多指标共染时，注意一抗必须来源不同物种；

共染时选择二抗荧光峰值相差大的荧光标记二抗以免串色；

操作步骤：

注意湿盒的保湿效果，避免样品的干燥；

流水清洗切片时，不能直接对着切片冲，以免脱片；

细胞和冰冻切片比较脆弱，洗涤时转速要温和；

合理设置实验对照组，排查抗体的特异性，以及是否存在自发荧光；

建议选用二抗种属来源的动物血清作为封闭液；

从孵育二抗开始，注意避光操作，尤其是紫外光的照射，以免荧光淬灭导致假阴性结果；

常见问题与建议：

1.背景太高：封闭不足；一抗浓度过高，减少用量；设置无一抗对照，帮助确认背景是否来源二抗，若二抗浓度过高，减少用量。

2.荧光太弱：可能是由多种原因引起的，可以检查曝光时间和强度；改变固定或孵育时间；确保抗体/同型的兼容性；测试抗体稀释范围和样品浓度；保证正确的试剂和载玻片的制备和储存方法；检查设备不兼容性。

3.非特异性染色：出现这样的情况时我们可以检查所用荧光团的光谱是否重叠，即调整滤镜和光源，更改为激发光谱或发射光谱没有重叠的荧光团；更换抗体；使用与二抗来源物种相同的血清作为封闭液；用针对一抗种属的单价Fab片段封闭一抗，然后用二抗对单价Fab片段进行可视化，可避免与样本本身的Fc受体结合而引起非特异染色等排除干扰因素。

注意事项:

1.减少非特异荧光染色

细胞的活性和状态:流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。

2.封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。

3.单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。

4.如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。

文章出自：石蜡切片免疫荧光    想了解更多请关注：http://www.vv-gene.com/