1.固定

灌流后的新鲜脑组织放入4%的多聚甲醛固定液(PFA)中，4度固定24小时

2.脱水

2.1使用1xPBS配制5%(m/v)和 30%(m/v)的蔗糖溶液。

2.2将 PFA换成5%(m/v)的蔗糖溶液，4 度脱水1小时

2.3 将 5%的蔗糖溶液换成 30%的蔗糖溶液，4度脱水 1-2 天，直至组织下沉。

3.OCT 包埋

3.1准备适量干冰和包埋盒，并在包埋盒底部加入一层opti-mum cuttingtemperaturecompound (O.c.T.Compound)O

3.2将脱水完全的脑组织取出，使用 OCT 进行润洗。

3.3用镊子夹取润洗后的组织，将要切片的一面平放在包埋盒中，加入OCT直至淹没组织，挤出OCT需用力均匀，避免产生气泡。

3.4 将含有组织的包埋盒放在干冰上，待组织慢慢冷冻。

4.存储

4.1若第二天直接进行冰冻切片，包埋好的组织应放在-80度冰箱过夜，以使组织在 OCT中冻的更完整。

4.2 若短期内不进行冰冻切片，包埋好的组织应放在液中保存，

5.切片

5.1第二天从-80度冰箱中取出包埋盒，将包埋盒放在冰上，使其温度平衡至-20 度左右。

5.2 解锁 Leica 切片机，将切片机温度和箱体温度设置为-20 度。

5.3 从包埋盒的底部将包埋块推出，使用OCT将包埋块固定在切片机的样品托上，然后将样品放置在冷台上进行冷冻，通过旋钮将样品托固定在切片机上，准备切片。

5.4通过切片机的厚度调节按钮来设定切片的厚度，常规冰冻切片一般厚度为8-12 微米若进行漂染 3D 重构等实验，则需要切40 微米。

5.5通过切片机的快进快退按钮来调节刀片和组织包埋块的距离，先进行修片，待切片能够完整地包含整个组织后，进行手动切片，并小心将切片贴在载玻片上，避免褶皱或破损。

5.6切片完成后，使用OCT将露出的组织重新包埋上，待慢慢冷冻好后，置于液中保存。

5.7 清理切片机和工作区域，将冰冻切片放在室温1小时，使组织在载玻片上贴的更牢固，之后冰冻切片可直接用于染色或存放在-80 度冰箱。

文章出自：OCT包埋和冰冻切片      想了解更多请关注：http://www.vv-gene.com/