（一）实验目的

利用抗原与抗体的特异性结合原理，检测组织中特定蛋白质的表达位置、表达强度，为病理分型、疾病诊断及预后评估提供分子水平依据。

（二）实验材料

1.  样本：已烤好的病理石蜡切片；2.  试剂：3%过氧化氢溶液、抗原修复液（柠檬酸盐缓冲液，pH6.0）、封闭液（山羊血清）、一抗、二抗（荧光标记或酶标）、DAB显色液、苏木素染液（复染用）、梯度酒精、二甲苯、中性树胶；3.  仪器：微波炉、恒温孵育箱、染色架、染色缸、显微镜、湿盒、移液器。

（三）实验步骤

1. 脱蜡至水：同HE染色步骤，二甲苯脱蜡2次（各10分钟）→梯度酒精脱水（无水乙醇→95%→90%→80%→70%，各5分钟）→自来水冲洗5分钟。

2. 灭活内源性过氧化物酶：将切片放入3%过氧化氢溶液中，室温孵育10-15分钟，阻断内源性过氧化物酶活性，避免干扰显色结果，然后用PBS缓冲液（pH7.4）冲洗3次，每次5分钟。

3. 抗原修复：将切片放入柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，置于微波炉中加热至沸腾，保持中低火加热10分钟，然后自然冷却至室温（抗原修复可使组织中被石蜡包埋的抗原暴露，增强抗原与抗体的结合能力），再用PBS冲洗3次，每次5分钟。

4. 封闭：将切片放入湿盒中，滴加适量封闭液（山羊血清），室温孵育30分钟，封闭非特异性结合位点，减少背景染色，孵育后无需冲洗，吸去多余血清即可。

5. 一抗孵育：根据实验需求，用抗体稀释液稀释一抗（稀释比例按抗体说明书调整，一般1:100-1:500），滴加在切片上，置于湿盒中，4℃冰箱孵育过夜（或室温孵育2小时，4℃孵育效果更稳定，特异性更强）。孵育完成后，用PBS冲洗3次，每次5分钟，去除未结合的一抗。

6. 二抗孵育：滴加对应种属的二抗（酶标二抗），放入湿盒中，室温孵育30分钟，使二抗与一抗特异性结合，然后用PBS冲洗3次，每次5分钟，去除未结合的二抗。

7. DAB显色：按说明书比例混合DAB显色液（A液+B液），滴加在切片上，室温下显微镜下观察显色情况（一般1-5分钟），当目标区域出现棕黄色阳性信号，且背景无明显染色时，立即用自来水冲洗，终止显色。

8. 复染：将切片放入苏木素染液中，复染3-5分钟，使细胞核染色，自来水冲洗后，用1%盐酸酒精分化3秒，再用自来水返蓝10分钟。

9. 脱水透明、封片：同HE染色步骤，梯度酒精脱水→二甲苯透明→中性树胶封片，晾干后观察。

10. 结果判断：显微镜下观察，阳性信号呈棕黄色，主要定位于细胞质或细胞核，根据染色强度和阳性细胞比例判断表达水平。

（四）注意事项

1.  抗原修复需严格把控温度与时间，微波炉加热至沸腾后保持中低火恒温10分钟，自然冷却至室温，过度修复易致组织脱落，修复不足则抗原暴露不完全，影响结合效率；

2.  一抗、二抗需按说明书比例用专用稀释液稀释，4℃孵育过夜时湿盒内需加足量蒸馏水保湿，避免切片干燥，孵育时间不足或抗体浓度不当易引发假阳性、假阴性结果；

3.  DAB显色需在显微镜下全程监测，待棕黄色阳性信号清晰且背景无明显着色时，立即用自来水彻底冲洗终止反应，显色过久会导致背景染色加深，干扰结果判读；

4.  实验全程需使用新鲜配制的试剂，PBS冲洗要充分，避免残留试剂相互干扰，同时保持切片湿润状态，防止抗原变性失效。

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