一、染色步骤

封闭

用5%空白山羊血清将样本完全覆盖，切片需放置于湿盒内，细胞孔板可直接将孔板密封好，置于37℃恒温恒湿培养箱孵育30min；

一抗稀释

按照说明书要求，将抗体稀释于抗体稀释液中；

一抗孵育

吸走封闭液，加入稀释后的一抗，4℃孵育过夜；

复温

将样本置于常温，复温15min；

洗涤

去除抗体工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；

二抗稀释

按照说明书要求，将抗体稀释于抗体稀释液中；

二抗孵育

避光室温1h；

洗涤

去除二抗工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；

染核/封片

在样本上滴加DAPI工作液，避光，室温，孵育10分钟；去除DAPI工作液，用缓冲液TBST洗涤1次，5分钟；用缓冲液TBS洗涤3次，每次5分钟；加入抗荧光衰减封片剂后，于荧光显微镜下观察并采集图像。

二、7大注意事项及技巧总结

封闭剂选择和二抗种属来源相同的血清，如果是直标一抗选择和一抗种属来源相同；

封闭时间不易过长，30-60min即可，且封闭后不用洗涤，直接加一抗孵育即可；

一抗孵育4℃过夜比较好，抗原抗体结合会比较充分；

选择高质量能满足免疫荧光应用和物种要求的一抗和荧光二抗，一抗二抗的稀释比例可以根据抗体说明书来，再结合自己具体的实验要求进行优化；

如果涉及到双标染色，切记要将两种蛋白的抗体来源种属区分开，二抗的荧光素也要区分开；

在洗涤过程中，一要注意动作轻柔，固定后的细胞比较脆弱，如果太过剧烈，很容易把细胞吹洗掉，二是洗涤时间要把握好，每次洗涤5min左右，三是切忌不要干片，防止背景过高；

细胞免疫荧光最好不封片，新手很容易在最后一步功亏一篑

文章出自：免疫荧光染色实验      想了解更多请关注：http://www.vv-gene.com/