一、实验原理

1、G+细胞壁结构致密(肽聚糖层厚)，且脂质少，乙醇不易渗入脱色；G-细胞壁结构疏松，且脂质含量多，乙醇易溶解脂质渗入脱色；

2、G+菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不易被乙醇脱色；G-含量少，易脱色；

3、G+等电点(pl2~3)比G-等电点(pl4~5)低，在同一pH条件下，G+比G-所带的负电荷多，故与带正电荷的碱性染料(结晶紫)结合牢固，不易被乙醇脱色。

二、实验材料

菌种管、接种环、洗瓶、酒精灯、玻片、滤纸、结晶紫、碘液、95％乙醇、稀释石炭酸复红染液、显微镜、香柏油等。

三、实验步骤

1、涂片：

①利用酒精灯外焰依次消毒接种环的环（垂直消毒）、金属丝、部分金属杆，冷却片刻；

②左手持生理盐水试管，右手持接种管（持笔法），取1~2环生理盐水至玻片；

③再次消毒接种环并贴于培养基内侧将其冷却；

④用环刮取培养基内少许菌体，涂于载玻片上，并将其与生理盐水充分混合，菌膜1cm²；

⑤再次对接种环进行灭菌处理，并放回原处。

2、干燥：最好在室温下自然干燥，或标本面朝上，置于离酒精灯火焰约16cm高处缓慢烘干，切不可放在火焰上灼烧。

3、固定：将于燥后的涂片用片夹夹住使标本面向上缓慢通过火焰三次，自然冷却。

4、染色：

①初染：滴加1~2 滴结晶紫覆盖菌膜(1min)，而后水洗(可背面冲洗；水流可控，可以正面一端流水冲洗)；

②媒染：滴加数滴碘液覆盖表面(1min)，而后水洗；

作用：媒染剂，使结晶紫与细菌结合更牢固。

③脱色：滴加 95%乙醇数滴，轻轻晃动玻片，至玻片上流下的酒精液无紫色为止(0.5~1min)，而后水洗；

④复染：滴加稀释石碳酸复红(或沙黄)染液数滴(1min)，而后水洗。

5、干燥：用滤纸干燥。

6、镜检：低倍镜→高倍镜→油镜：滴 1~2 滴香柏油于油镜下观察。

四、结果判断

革兰阳性球菌，呈葡萄串状排列。

五、注意事项

1、操作因素

涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀可影响染色效果；

固定时避免菌体过分受热；

2、细菌因素

菌龄最好18~24小时，如G+培养时间过长，或已死亡及部分自行溶解，均呈阴性反应；

3、染液因素

所有染液都应防止蒸发而影响浓度，特别是碘液久存或受光易失去媒染作用；

脱色酒精95%为宜，若密封不良或涂片积水太多会影响浓度；

脱色时间：要根据涂片厚薄而定，不宜过长或过短；过长G+误认为G-；过短G-误认为G+

文章出自：革兰染色实验      想了解更多请关注：http://www.vv-gene.com/