实验步骤

（1）摊片：切片放65℃摊片机40min-1h。

（2）脱蜡水化：二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→100 % 乙醇Ⅰ（10 min）→100 % 乙醇Ⅱ（10 min）→95 % 乙醇（5 min）→85 % 乙醇（5 min）→ 75 % 乙醇（5 min）

（3）洗片：双蒸水洗5min×3次，PBS洗5 min×3次。

（4）阻断：3% 过氧化氢37℃ 阻断20min，PBST 5 min×3次。

（5）高温高压抗原修复：将盛有枸橼酸盐/柠檬酸盐抗原修复缓冲液的染色缸置于高压锅中加热至沸腾，将切片放入染色缸内，保证抗原修复缓冲液没过病理组织，待高压锅喷气时开始计时2 min。修复完成后，待修复液自然冷却至室温后取出组织切片，PBST洗片5 min×3次。

（6）血清封闭：组织切片滴加一滴正常山羊血清封闭液，37℃ 孵育30min。

（7）孵育一抗：组织切片上滴加目的一抗，置于4℃12-16h。

（8）组织切片在室温复温30min，PBST洗片5 min×3次。

（9）在组织切片滴加生物素标记的山羊抗兔IgG二抗，在37℃孵育30 min，PBST 洗片5 min×3次。

（10）组织切片滴加链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，37℃ 孵育30 min，PBST洗片5 min×3次。

（11）DAB显色：避光配置DAB显色剂（稀释液：底物：色原 =20:1:1 ）, 现用现配。组织切片滴加DAB 显色剂，放置显微镜下观察，显色完毕后立即将组织切片放入双蒸水中终止显色。

（12）苏木素核染：组织切片滴加苏木素染细胞核1 min，充分水洗后在镜下观察染色情况，颜色浅则继续复染，如颜色过深则置于1% 盐酸酒精中分化，最后使用自来水冲洗使细胞核颜色反至天蓝色。

（13）常规脱水、透明：75 % 乙醇（5 min）→ 85 % 乙醇（5 min）→95 % 乙醇（5 min）→100 % 乙醇Ⅱ（10 min）→100 % 乙醇Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10 min）→二甲苯Ⅰ（10 min）

（14）中性树胶封片、自然风干、标注，正置显微镜下观察并拍照（放大倍数：×200 ）

文章出自：免疫组化（IHC）   想了解更多请关注：http://www.vv-gene.com/