关键词：原位杂交

原位杂交（in situ hybridization）用特定标记的已知碱基序列核酸作为探针与组织、细胞中待检测核酸按碱基互补配对的原则在原位进行特异性结合，形成杂交体，然后用与标记物相应的监测系统，通过免疫组织化学方法在被检测核酸原位进行细胞内核酸定位。原位杂交可根据检测物而分为细胞内和组织切片原位杂交；根据其用探针及检测核酸的不同可分为DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA杂交。根据标记方法不同可分为放射性探针和非放射性探针。

其基本方法包括：固定、切片、杂交、显色等主要步骤。

(一)取材与标本固定

1． 取材 对于原位杂交所用的材料要尽可能新鲜，为了防止RNA的降解，取材要快一些，取材后要尽快固定或冷冻保存运输。

2． 固定 进行原位杂交的组织或细胞必须经过固定处理，固定的目的是为了①保持细胞形态原有结构；②最大限度保存细胞内的DNA或RNA的水平；③使探针易于进入细胞或组织内。

3． 固定液 常用固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、冰醋酸-酒精混合液、Bouin氏固定液等。这些固定液都有不同的优缺点因此要根据具体的实验对象，选择最适合的固定液。

4． 固定方法 组织标本取材后，迅速放入固定液中2～4h，取材组织大小为1cm×1cm×0.5cm，不宜太大。必要时，动物组织可进行灌流固定，然后将组织按要求取材放入20%蔗糖中，4℃过夜，次日可以进行冰冻切片。

(二)切片及细胞标本的制备

1． 载玻片的处理 因为原位杂交一般在载玻片上进行，所以载玻片必须保持清洁且不能有任何核酸酶的污染。一般载玻片可先经洗衣粉浸泡过夜，用流水冲洗、酸中浸泡4～8h，再用流水冲洗，双蒸水洗2～3次。在160℃烤箱中烘烤2～4h。亦可经15磅高压灭菌20分钟处理，可将载玻片上的核酸酶去除。

2． 组织切片和预处理

（1）冰冻切片：新鲜组织也可在取材后，直接置入液氮中迅速骤冷，冷冻切片后，4％多聚甲醛固定5～10分钟，也可保存在-70℃中待用。杂交前切片迅速恢复至室温并干燥，0.1mol PBS洗三次，2×SSC洗10分钟，滴加预杂交液室温孵育1小时。

（2）石蜡切片：组织固定后，常规石蜡包埋切片，可长期保存，随时用于原位杂交。杂交前切片经①二甲苯脱蜡2次，每次10分钟；②纯酒精洗2次，每次5分钟；③空气干燥5分钟；④梯度酒精复洗95％，80％，70％各1分钟；⑤0.1 mol PBS洗3次，每次5分钟；⑥2×SSC洗10分钟；⑦滴加预杂交液于湿盒内室温孵育1小时。

（3）培养细胞：每张载玻片滴加200μl浓度为1×105/m1的细胞悬浮液，空气干燥1～2分钟制成细胞涂片，也可直接用培养细胞盖片。上述细胞片经酒精或多聚甲醛固定5分钟，其余步骤和冰冻切片一样。

(三)试剂配制

配制溶液过程中需要戴手套，液体配制均用超净水，所用瓶子均经160℃烘烤4h，主要目的是去除RNA酶。

1． DEPC水 将DEPC按1‰浓度加入超净水中，充分混合后静置过夜，15~20分钟高压消毒，之后室温避尘存放。

2． 0.1mol PBS pH 7.4

A液：0.1mol NaH2PO4为NaH2PO4 (MW：156.01，2H2O) 1.56g；DEPC水 100.00m1。

B液：0.1mol Na2HP04为Na2HPO4 (MW：358.14，12H2O) 17.907g；DEPC水 500.00m1。

A液：B液＝9.5∶40.5 加NaCl使其浓度达0.85％。

3． 20×SSC 为NaCl(3mol/L) 8.765g；Na3C6H50H2O7·2(0.3mol/L) 4.410g；DEPC水50.00m1。

4． 4％多聚甲醛(pH 7.4) 为多聚甲醛4g；0.1mol PBS 100m1。

5． 缓冲液

（1） 缓冲液Ⅰ(pH 7.5) 为1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；消毒超净水加至1000ml。

（2） 缓冲液Ⅱ(pH 9.5) 为1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超净水加至1000ml。

（3） 缓冲液 Ⅲ(pH 9.5) 为1mol Tris-HCl 100ml；1molEDTA 5ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超净水加至1000ml。

6． 去离子甲酰胺 将阴阳离子交换树脂各5g加入50ml甲酰胺中，待树脂下沉后用上清液。

7． 50％硫酸葡聚糖 5g硫酸葡聚糖加10ml DEPC水，不断搅动直至完全溶解。

8． 50×Denhardt's液 为1％Fico11type 400（聚蔗糖） 0.2g；1％PVP（聚乙烯砒硌烷酮）0.2g；1％BSA（牛血清白蛋白）0.2g；DEPC水 20.0ml。

9． 预杂交液 为去离子甲酰胺5.0m1；20×SSC 2.0m1；鲑鱼精DNA (10mg/m1) ；0.5ml（沸水变性10分钟）；酵母tRNA (10mg/m1) 0.25m1；50％硫酸葡聚糖 2.00m1；50×Denhardt?蒺s液 0.20ml。

(四)杂交与显色

1．杂交 将已标记的探针加入预杂交液即成为杂交液（探针浓度为1μg/m1），切片经2×SSC短暂浸洗后，滴加杂交液，于湿盒内置37℃或42℃孵育过夜。然后依次经2×SSC室温浸洗1h，l×SSC室温浸洗lh，0.5×SSC 37℃浸洗30min，0.5×SSC室温浸洗30分钟。注意滴加杂交液时切片勿干燥。

2． 显色 以下各步都要在室温下进行。

（1）缓冲液I洗1分钟。

（2）用含2%正常羊血清和0.3％TritonX-100的缓冲液I孵育切片30分钟。

（3）用含1％正常羊血清和0.3％TronX-100的缓冲液I稀释羊抗Dig抗体。

（4）将抗体稀释液滴加在切片上，封口膜覆盖，湿盒内4℃孵育过夜。

（5）缓冲液I洗10分钟。

（6）缓冲液Ⅱ洗10分钟。

（7）加显色液，封口膜覆盖，避光室温孵育2～20h，随时镜检，当显色满意时入缓冲液Ⅲ终止显色。

显色液临用前配，其配方为：①NBT 45μl；②X-Phospllate液 35μl；③左旋咪唑 2.4mg；④缓冲液Ⅱ 加至10ml。

（8）常规脱水、透明、封固。

结果：杂交阳性信号为紫蓝色颗粒。

(五)原位杂交对照试验

同免疫组织化学染色对照一样，为证明原位杂交实验操作的准确性和实验结果的特异性，需要设置一系列对照实验，具体的各种对照实验的设置及其意义请参考原位杂交专著，以下仅介绍几种常用的对照实验。

1． 省去标记探针 在做原位杂交时，以PBS或预杂交液替代杂交液，结果应该是阴性，这是一种简单而有意义的阴性对照实验。如省去标记探针仍出现阳性反应，这肯定是假阳性。

2． 自身对照 用同一组织切片或涂片上与靶序列无关的其他结构作对照。阳性与阴性结构同在一个视野中，相互印证，这本身就是对阳性反应的特异性对照。

3． 阴性对照 用已知不存在相应靶序列的组织标本杂交，结果应为阴性。阴性对照可排除在杂交过程中由于非特异性杂交反应等因素造成的假阳性结果。

4． 阳性对照 用已知含靶序列的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性，称阳性对照。通过阳性对照可证明杂交过程中各个步骤以及所使用的试剂都合乎标准，实验方法可靠。尤其当待检标本为阴性时，阳性对照片呈阳性反应可排除待检标本假阴性的可能。故若预期杂交结果为阴性时，就必须设阳性对照，当阳性对照亦不显色，就证明杂交过程的某一步骤或所用试剂问题。