(1)切片后固定，固定时间为30s-1min，清水稍冲洗1-2s。

(2)玻片浸没于含苏木素的染缸中，时间大概为3-5min;然后清水洗去苏木素，大概5-10s。

(3)再把玻片浸没于1%盐酸乙醇2s;然后清水冲洗1-2s。这个时候在显微镜下观察，细胞核呈紫蓝色，细胞浆无色说明操作无误。

(4)促蓝液(可以是自来水，或者是1%氨水)返蓝5-10s;清水稍冲洗1-2s，显微镜下观察，细胞核蓝色说明操作无误。

(5)再把玻片浸没于含伊红的染色缸中30-60s，然后清水冲洗干净表面。显微镜下观察，细胞核蓝色，细胞浆为红色说明操作无误。

(6)染色完的片子需要做透明处理来延长保存时间。利用不同浓度的酒精(从低浓度-高浓度)和二甲苯进行该项操作。显微镜下观察，细胞核蓝色，胞质:肌纤维、胶原纤维和红细胞呈现出深浅不一的红色。

(7)中性树胶封片，染色完成。

注意事项:

1.染色时调节pH值很重要。若组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

2.切片染苏木精后，分色是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚(晰)而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。

3.切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。

4.在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。

5.切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

6.最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

7.避免切片污染。出现切片污染，污染物遮盖该部位的细胞或组织难以观察期形态改变。应定期过滤各种染液和试剂以避免其中的沉淀物所引起的污染。

8.冬季室温低时(14℃C以下)，二甲苯应在水浴缸中适当加温到30℃C后再脱蜡，以避免因脱蜡不完全引起的染色不均匀呈雾化状态。

9.彻底脱水与透明。切片经酒精脱水后，过二甲苯时若为白色不透明状态，为脱水不彻底，应将切片用酒精、二甲苯重新脱水与透明。

10.保持切片的湿润。在染色过程中不要让切片干燥,以免组织收缩、变形，影响神经元形态。

11.封片注意事项。封片时要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，树脂封固时不能有气泡。

文章出自：组织冰冻切片染色实验    想了解更多请关注：http://www.vv-gene.com/